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If the problem continues, please let us Rilevamento o rilevazione dating and we'll try to help. An unexpected error occurred. Due protocolli per i veicoli elettrici di misurazione sono presentate, utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone. Click here for the english version. For other languages click here. Extracellulare vescicole EV sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono altamente coinvolti nella comunicazione cellula-cellula Rilevamento o rilevazione dating aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici.

Metodi di analisi Rilevamento o rilevazione dating, mentre notevolmente migliorato nel corso dell'ultimo decennio, sono ancora un work in progress. Presentato qui sono diverse tecniche per i veicoli elettrici di trasformazione e di due protocolli per l'analisi i veicoli elettrici utilizzando il rilevamento individuo Rilevamento o rilevazione dating di un approccio basato tallone.

EV, noto anche come microparticelle, sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono coinvolti nella comunicazione cellula-cellula e aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici 1. La maggior parte d'accordo, tuttavia, che le variabili pre-analitiche strettamente controllate sono cruciali per dati accurati e riproducibili. Per analizzare i veicoli elettrici, i ricercatori hanno utilizzato Rilevamento o rilevazione dating metodi, tra cui microscopia elettronica a trasmissione 17, microscopia elettronica a scansione 18,19, microscopia a forza atomica, luce dinamica spargendo 20,21 e occidentale blotting 22, Sfide comuni tra i ricercatori sono i segnali derivanti da aggregati di immunoglobuline 27,28 e di auto-aggregazione Rilevamento o rilevazione dating anticorpi Alcuni ricercatori rinunciano una fase di lavaggio del tutto, rendendo utilizzati tradizionalmente controlli negativi FCM, come una fluorescenza meno FMO e isotipi anticorpali inutile per valutare con precisione bacfluorescenza kground I nostri protocolli affrontano tre problemi comuni che possono impedire la corretta analisi FCM dei veicoli elettrici: Due diversi metodi di rilevamento sono presentati qui: Please recommend JoVE to your librarian.

Tutti i campioni soggetti umani sono stati testati in un comitato di revisione istituzionale IRB Protocollo -approvato e con il consenso informato dei soggetti. Figura 1 illustra lo schema di elaborazione globale per l'isolamento e la rilevazione dei veicoli elettrici utilizzando sia il metodo basato bead-o metodo di rilevamento individuale. Quando EVs colorate non vengono lavati prima di leggere, comunemente usato controlli negativi ad esempio, isotipi non riescono a prevedere con precisione sfondo fluorescence per tutti gli indicatori Figura 5A.

Tuttavia, quando EVs macchiati vengono lavati prima lettura utilizzando filtrazione centrifuga, in questo casoentrambi i controlli negativi isotipi e campioni lisati funzionano bene per prevedere fluorescenza di fondo di un campione Figura 5A. Inoltre, controlli isotipici possono talvolta essere inaffidabile, anche in campioni lavati, come mostrato in Figura 5B, in cui il campione colorato ha meno eventi positivi rispetto allo stesso campione colorato con anticorpi isotipo di controllo corrispondenti.

Senza la rimozione completa di anticorpo non legato, trame FCM dot di alcuni marcatori EV sono quasi impossibili da interpretare, che appaiono come nuvole di Rilevamento o rilevazione dating debolmente fluorescenti indistinguibili dallo sfondo altamente fluorescente Rilevamento o rilevazione dating 6, trama top.

Lavaggio campioni macchiati utilizzando filtri centrifughi migliora la separazione tra sfondo e segnali marcatori positivi Figura 6, la trama di fondo ; Tuttavia, piccoli veicoli elettrici e exosomes possono essere persi attraverso i pori del filtro. Questi eventi detergenti resistenti appaiono spesso segnali diagonali come sospette, altamente fluorescenti in entrambi i singoli parametri e biparameter trame Figura Rilevamento o rilevazione dating. A di sangue intero viene prima trasformato in PPP.

B Schema di suggerito map piastra per l'analisi dei campioni alto rendimento con il metodo di rilevazione individuale. Risultati attesi per rilevamento individuale citometria a flusso dot plot mostrano colorazione rappresentativo di campioni EV lisati e non lisati.

I valori mostrano percentuali di eventi positivi. La maggioranza degli eventi rientrano nel cancello EV. Il campione lisato fila in basso viene utilizzato per impostare porte fluorescenti-based per EAch corrispondente non lisato del campione.

Porte Quad non dovrebbero rivelare eventi doppi positivi quando i due marcatori di confronto non si trovano normalmente nella stessa cella. Qui, il CDa biparameter e CD41a grafico mostra una netta separazione tra i veicoli elettrici che esprimono i marcatori dei globuli rossi e quelli che esprimono marcatori cellulari piastrinica. Quando lisato, eventi positivi dovrebbero scomparire.

Risultati attesi utilizzando il rilevamento basato bead- metodo. Citometria a flusso dot plot mostrano colorazione rappresentante dei veicoli elettrici accoppiati a perline, rispetto a perle bloccati con BSA, che serve come controllo negativo. Per il metodo di rilevamento basato su perline, i dati sono meglio analizzati utilizzando sovrapposizioni istogramma con il controllo negativo raffigurato sotto le trame dot.

Confronto dei risultati attesi con perle contro rilevamento individuale Citometria a flusso punteggiano grafici mostrano colorazione rappresentante dei veicoli elettrici Rilevamento o rilevazione dating a perline riga in altorispetto ai veicoli elettrici che analizzano con rilevamento individuale fila in basso. Confronto tra diversi controlli negativi in analisi di rilevamento individuale Valori mostrano percentuali di eventi positivi.

A Confronto di controlli negativi in contro non lavato lavato campioni. Gates per ogni marcatore sono state effettuate utilizzando il campione lisato riga in alto e poi copiato le righe sottostanti. Lavato campioni sono stati lavati con filtrazione post-macchia. Effetto del post-macchia lavaggio in rilevazione individuale Valori mostrano le percentuali e il numero di eventi positivi.

Gates per ogni campione sono state effettuate utilizzando controparte di ogni Rilevamento o rilevazione dating lisato non mostrato, fare riferimento alla figura precedente per cancello-impostazione in non lavato vs campioni lavati. Alta fluorescenza di fondo fa distinguere positivo da eventi negativi difficile trama top. Campioni EV Stained sono state lette prima colonna di sinistra e dopo l'aggiunta di detersivo colonna di destra per identificare segnali positivi causati da immunocomplessi e altri eventi Rilevamento o rilevazione dating. EV campioni macchiati sono stati letti prima Rilevamento o rilevazione dating di sinistra e dopo l'aggiunta di detergente colonna di destra.

In generale, il numero di eventi all'interno di un cancello positivo non dovrebbe aumentare Rilevamento o rilevazione dating lisi. Pro e contro di entrambi i metodi di rilevamento. Sono stati presentati due diversi protocolli per l'isolamento, il trattamento e l'analisi dei veicoli elettrici, utilizzando un rilevamento individuo o approccio basato bead.

Idealmente, diversi differenti tecniche di isolamento e di rilevamento devono essere valutati in primo luogo per sviluppare un protocollo su misura che tenga conto individuale citometro prestazioni rispetto alla popolazione EV specifica fase di studio.

Tuttavia, ci sono svantaggi associati all'uso di questo metodo, come indicato nella Tabella 1. La mancanza di un citometro a rilevare la maggioranza di particelle inferiori a 1,0 micron comporta un impiego del protocollo basato tallone. Marcatori altamente espresse sono facilmente rilevati utilizzando il protocollo. Rilevamento o rilevazione dating tecniche di isolamento devono essere utilizzati quando sono necessarie veicoli elettrici per le applicazioni a valle.

Il metodo di rilevazione individuale, d'altra parte, richiede controlli separati da leggere per ciascun campione analizzato. Il protocollo qui descritto utilizza una centrifugazione a 1.

Per esempio, alcuni anticoagulanti ad esempio, EDTA e eparina sono noti per interferire con reazioni PCR, mentre altri per esempio, teofillina, adenosina e dipiridamolo hanno dimostrato di inibire il Rilevamento o rilevazione dating EV dalle piastrine Gli autori desiderano ringraziare Dale Hirschkorn da sistemi Sangue Research Institute per il suo aiuto con citofluorimetro impostazioni dello strumento.

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Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content. Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access: Individual Metodo di Rilevamento o rilevazione dating 1. Centrifugare i campioni a 1. Se sono necessarie EV purificate per esperimenti funzionali, di trasferimento di 6 ml di PPP per un tubo ultracentrifuga e aggiungere 28 ml di 0,2 tampone fosfato micron filtrata PBS.

Spin per 60 min a Aspirare il surnatante e risospendere EV pellasciate in 1,5 ml media. Ogni variazione nel metodo di isolamento EV potrebbe avere un impatto significativo il numero e il tipo di veicoli elettrici rilevati.

Togliere ml da ogni campione e aggiungere alla riga superiore di una piastra ben Conservare cocktail Ab in frigorifero per un massimo di due settimane, ma ri-filtro ogni volta prima dell'uso. Fare riferimento alla Figura 1B per un contorno di mappa piatto suggerito. Cambia suggerimenti e ripetere, trasferendo ml dalla fila 1 alla fila 3 e 4. Chiudi cime di filtri centrifughi. Ripetere questa operazione con i restanti campioni macchiati fino a quando tutti i campioni di PPP colorati sono stati trasferiti con le Rilevamento o rilevazione dating soluzioni di risciacquo ai Rilevamento o rilevazione dating centrifughi.

Assicurarsi che rimanga liquido sulle cime del filtro. Dopo centrifugazione, il filtro deve apparire "secco" senza strato fluido rimanente visibile sulla parte superiore. Rimuovere i tubi filtranti centrifughe e tornare alla cappa di sicurezza biologica.

Utilizzando la pipetta multicanale, sospendere nuovamente le cime dei filtri in ml di PBS. Trasferire il contenuto in sospensione al tubi pre-etichettati per l'immediata analisi FCM. E 'molto importante mantenere la forza e il numero di depressioni pipetta stantuffo coerenti tra campioni per evitare variazioni campione a campione.

Prima di sperimentare l'installazione, eseguire la calibrazione dello strumento quotidiano e configurazione utilizzando perline di impostazione strumento seguendo le istruzioni del produttore.

Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione negativi a un altro tubo da utilizzare come il controllo di compensazione senza macchia. Utilizzando il citofluorimetro software fornito con lo strumento, eseguire ogni tubo di compensazione e regolare tensioni fluorescenti per posizionare ogni picco di circa 10 4 su una scala logaritmica 5-decade.

Eseguire ogni tubo bozzetto singolarmente macchiato e catturare almeno 5. Selezionare "Experiment", scheda e selezionare "compensazione", quindi selezionare "Calcola compensazione" per applicare valori di compensazione per tutti i campioni. Successivamente, eseguire una provetta contenente 0,2 micron - 1,0 micron perline, diluito in PBS, se necessario.

In un FCS e SSC plot, disegnare un cancello intorno popolazione tallone per acquisire gli eventi tra 0,2 micron e 1,0 micron. Eseguire un tubo di particelle fluorescenti arcobaleno diluito in PBS.

E 'estremamente important che i campioni essere miscelati utilizzando una pipetta piuttosto che un vortice. Una Rilevamento o rilevazione dating che tutti i campioni sono stati letti, esportare tutti i file. Importare tutti i file. Aprire il perline solo tubo. Trascinate da aggiungere a tutti i campioni.

Gli strumenti di bordo utilizzano per la raccolta delle informazioni e la loro visualizzazione diversi principi di funzionamento tra cui: La lista qui sotto non ha alcuna delle logiche elencate. La bussola mostra l'angolo di "prua" del velivolo rispetto al nord magnetico. Per questo motivo si usa anche la girobussola o direzionale. L' altimetro mostra l' altitudine del velivolo confrontando la pressione all'interno di una capsula aneroide contenuta nell'altimetro con la pressione atmosferica ottenuta dall'impianto delle prese statiche.

Quando l'aereo sale, la capsula aneroide si espande, dal momento che diminuisce la pressione statica. Al contrario, durante la discesa, la pressione statica aumenta e la capsula si ricomprime. Si basa sulla misura della pressione dinamica ottenuta dai tubi di Pitot.

La girobussola anche nota come girodirezionale o semplicemente direzionale , mostra la rotta del velivolo rispetto al nord geografico. Le tacche graduate ed i triangoli bianchi sopra l'orizzonte indicano la posizione in virata del velivolo, integrando lo strumento anche la funzione di virometro o indicatore di virata.

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